Ano ang pinagbabatayan ng DNA hybridization? Bagama't ang double-stranded na pagkakasunud-sunod ng DNA ay karaniwang matatag sa ilalim ng mga kondisyong pisyolohikal, ang pagbabago sa mga kundisyong ito sa laboratoryo (karaniwan ay sa pamamagitan ng pagtaas ng temperatura sa paligid) ay magiging sanhi ng paghihiwalay ng mga molekula sa mga indibidwal na hibla. Ang huli ay pantulong sa isa't isa, ngunit maaari ring umakma sa iba pang mga pagkakasunud-sunod na naroroon sa kanilang kapaligiran. Ang pagbaba sa temperatura ng kapaligiran ay nagpapahintulot sa mga single-stranded na molekula na mag-anneal o "mag-hybridize" sa isa't isa. Ito ang paraan ng DNA hybridization.
Ang konsepto mula sa punto ng view ng molecular biology
Ang mga siyentipiko na kasangkot sa parehong DNA replication at ang transkripsyon ng DNA sa RNA ay umaasa sa mga nucleotide crossover at molecular biology techniques. Kabilang dito ang Southern at Northern blots, polymerase chain reaction (PCR), at karamihan sa DNA-RNA hybridization at sequencing approach.
Application
Ang
Hybridization ang pangunahing katangian ng nucleotidesequences at ginagamit sa maraming paraan ng molecular biology. Ang pangkalahatang genetic na relasyon ng dalawang species ay maaaring matukoy sa pamamagitan ng hybridizing segment ng kanilang DNA (DNA-DNA hybridization). Dahil sa pagkakatulad ng pagkakasunud-sunod sa pagitan ng mga malapit na nauugnay na organismo, kinakailangan ang isang mas mataas na temperatura upang matunaw ang naturang mga hybrid ng DNA kumpara sa mas malayong mga organismo. Gumagamit ang iba't ibang paraan ng hybridization upang matukoy ang pinagmulan ng isang sample ng DNA, kabilang ang polymerase chain reaction (PCR). Sa isa pang pamamaraan, ang mga maikling pagkakasunud-sunod ng DNA ay na-hybrid sa cellular mRNA upang makilala ang mga ipinahayag na gene. Sinasaliksik ng mga kumpanyang parmasyutiko ang paggamit ng antisense RNA upang magbigkis sa hindi gustong mRNA, na pumipigil sa ribosome sa pagsasalin ng mRNA sa protina.
Ang
DNA-DNA hybridization sa pangkalahatan ay tumutukoy sa isang molecular biology technique na sumusukat sa antas ng genetic na pagkakatulad sa pagitan ng mga pool ng DNA sequence. Ito ay karaniwang ginagamit upang matukoy ang genetic na distansya sa pagitan ng dalawang organismo. Ito ay malawakang ginagamit sa phylogeny at taxonomy.
Methodology
Ang
DNA mula sa isang organismo ay nilagyan ng label, pagkatapos ay hinaluan ng walang label na DNA na maaaring ihambing dito. Ang pinaghalong ay incubated upang payagan ang mga DNA strands na maghiwalay at pagkatapos ay palamig upang bumuo ng isang regenerated hybrid double stranded DNA. Ang mga naka-hybridized na pagkakasunud-sunod na may mataas na antas ng pagkakatulad ay magbubuklod nang mas mahigpit at mangangailangan ng mas maraming enerhiya upang paghiwalayin ang mga ito: ibig sabihin, naghihiwalay ang mga ito kapag pinainit sa mas mataas.temperatura kaysa sa magkakaibang sequence, isang prosesong kilala bilang "DNA melting".
DNA melting
Pagsusuri sa natutunaw na profile ng hybridized na DNA, ang double-stranded na DNA ay nakatali sa isang tinatawag na "column" at ang nagresultang timpla ay pinainit. Sa bawat hakbang, hinuhugasan ang column at ang mga sequence ng DNA na natutunaw ay nagiging single stranded at nahuhugasan ang column. Ang mga temperatura kung saan lumabas ang may label na DNA sa column ay sumasalamin sa dami ng pagkakapareho sa pagitan ng mga sequence (at ang pattern ng self-folding ay nagsisilbing kontrol). Ang mga resultang ito ay pinagsama upang matukoy ang antas ng pagkakatulad ng genetic sa pagitan ng mga organismo. Ayon sa modernong microbiology, imposible ang pag-hybrid ng DNA nang hindi nauunawaan ang mga bagay na ito.
Kapag ang maramihang ribonucleic acid (o deoxyribonucleic) acid species ay inihambing sa ganitong paraan, ang mga halaga ng pagkakatulad ay nagpapahintulot sa mga species na mailagay sa phylogenetic tree. Samakatuwid, ito ay isa sa mga posibleng diskarte upang magsagawa ng mga sistematikong molekular. Sina Charles Sibley at John Ahlquist, ang mga pioneer ng teknik na ito, ay gumamit ng DNA-DNA hybridization para pag-aralan ang phylogenetic na relasyon ng mga ibon (Sibley-Ahlquist taxonomy) at primates.
Kahalagahan para sa biology
Ang
DNA-DNA hybridization ay ang gold standard para sa pagkilala sa bacterial species, na may similarity value na higit sa 70%, na nagpapahiwatig na ang mga pinaghahambing na strain ay nabibilang sa iba't ibang species. Noong 2014, iminungkahi ang threshold na 79% na pagkakatulad para sa paghihiwalay ng isang bacterial subspecies.
Ipinaninindigan ng mga kritiko na ang pamamaraan ay hindi tumpak para sa paghahambing ng malapit na nauugnay na mga species, dahil ang anumang pagtatangka na sukatin ang mga pagkakaiba sa pagitan ng mga orthologous sequence sa pagitan ng mga organismo ay nalulula sa hybridization ng mga paralogous na katapat sa genome ng isang organismo. Ang DNA sequencing at computational sequence comparisons ay kasalukuyang karaniwang ginagamit na paraan para sa pagtukoy ng genetic distance, bagama't ang diskarteng ito ay ginagamit pa rin sa microbiology para tumulong sa pagtukoy ng bacteria.
Ang kasalukuyang paraan ay ang pagsasagawa ng DNA-DNA hybridization sa silicone gamit ang ganap o bahagyang sequenced na mga genome. Ang GGDC na binuo ng DSMZ ay ang pinakatumpak na kilalang tool para sa pagkalkula ng mga halagang tulad ng DDH. Kabilang sa iba pang mga algorithmic na pagpapahusay, nilulutas nito ang problema sa mga paralogous sequence sa pamamagitan ng maingat na pag-filter sa mga ito mula sa mga tugma sa pagitan ng dalawang genome sequence.
FISH method
Ang
Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) ay isang pamamaraan sa laboratoryo na ginagamit upang tuklasin at i-sequence ang DNA, kadalasan sa isang partikular na chromosome.
Noong 1969, naglathala sina Joseph Gall at Mary Lou Pardu ng isang papel na nagpapakita na ang mga radioactive na kopya ng isang ribosomal DNA sequence ay maaaring gamitin upang makita ang mga pantulong na pagkakasunud-sunod ng DNA sa nucleus ng isang itlog ng palaka. Dahil ang mga orihinal na obserbasyon na ito, maraming mga refinement ang nagpapataas ng versatility atang sensitivity ng pamamaraan sa isang lawak na ang in situ hybridization ("sa lugar", Latin) ay itinuturing na ngayon na isang mahalagang kasangkapan sa cytogenetics. (Ginagamit na rin ngayon ang terminong in situ upang tumukoy sa unang yugto ng paglaki ng carcinoma, kapag ang epithelial tissue lamang ang kasangkot sa proseso ng pathological.)
Fluorescent hybridization sequence
Maaaring idisenyo ang
RNA probes para sa anumang gene o anumang sequence sa loob ng isang gene para makita ang lncRNA at miRNA mRNA sa mga tissue at cell. Ang FISH ay ginagamit sa pamamagitan ng pag-aaral ng cycle ng cell reproduction, lalo na ang nuclear interphase para sa anumang chromosomal abnormalities. Binibigyang-daan ka ng FISH na suriin ang isang malaking serye ng mga kaso ng archival, mas madaling matukoy ang natukoy na chromosome sa pamamagitan ng paggawa ng probe na may artipisyal na chromosome base na makakaakit ng mga katulad na chromosome.
Mga signal ng Hybridization para sa bawat probe kapag may natukoy na nuclear abnormality: bawat mRNA at lncRNA detection probe ay binubuo ng 20 pares ng oligonucleotides, ang bawat pares ay sumasaklaw sa espasyo na 40-50 bp. p. Gumagamit ang mga probe ng proprietary chemistry para makita ang mRNA.
Hybridization na may DNA probes
Ang mga probe ay kadalasang ginawa mula sa mga fragment ng DNA na na-isolate, na-purified at pinalakas para magamit sa disenyo ng genome ng tao. Ang laki ng genome ng tao ay napakalaki kumpara sa haba na maaaring direktang sequence kaya kailangan itong hatiin samga fragment. Sa huli, ang mga fragment na ito ay inayos sa pamamagitan ng pag-digest ng kopya ng bawat fragment sa mas maliliit na unit gamit ang sequence-specific endonucleases para sukatin ang laki ng bawat maliit na fragment gamit ang size exclusion chromatography gamit ang impormasyong ito para matukoy kung saan nag-overlap ang malalaking fragment sa isa't isa..
Upang mapanatili ang mga elemento kasama ng kanilang mga indibidwal na pagkakasunud-sunod ng DNA, idinagdag ang mga fragment sa isang sistema ng paulit-ulit na populasyon ng bacterial. Ang mga clonal na populasyon ng bakterya, bawat populasyon na nagpapanatili ng isang solong artipisyal na kromosoma, ay nakaimbak sa iba't ibang mga laboratoryo sa buong mundo. Ang mga artificial chromosome (BACs) ay maaaring palaguin, i-extract at lagyan ng label sa anumang laboratoryo na naglalaman ng library. Ang mga genomic na aklatan ay madalas na pinangalanan sa mga institusyon kung saan sila binuo. Ang isang halimbawa ay ang RPCI-11 library, na pinangalanang Roswell Cancer Institute sa Buffalo (New York, USA). Ang mga fragment na ito ay bumubuo ng humigit-kumulang 100 libong base pairs at ang batayan ng karamihan sa mga FISH probe.
