Paglilinang ng bakterya: mga pamamaraan, prinsipyo, hakbang at kundisyon

2024 May -akda: Angel Austin | [email protected]. Huling binago: 2023-12-17 05:44

Ang mga mikroorganismo sa kalikasan sa ating paligid ay nasa lahat ng dako: sa mga lupa, anyong tubig, sa ibabaw ng iba't ibang bagay, ang mga tao at hayop ay tinitirhan nila. Ang lahat ng ito ay maaaring magsilbi bilang mga mapagkukunan ng microbial contamination ng pagkain, gamot, at mga linya ng produksyon. Ang paglilinang ng bakterya ay kinakailangan upang pag-aralan ang kanilang mga katangian, pangangailangan, at katangian. Ito naman ay isang mahalagang hakbang sa pagbuo ng iba't ibang gamot, pagsusuri sa laboratoryo ng mga sakit, pagkalkula ng mga production reactor at marami pang iba.

Mga pangkalahatang konsepto

Ang paglilinang ng bakterya sa microbiology ay tumutukoy sa paglilinang ng mga mikroorganismo na isinasagawa sa laboratoryo. Sa turn, ang mga mikrobyo na lumaki sa isang napiling nutrient medium ay tinatawag na kultura. Ang mga kultura ay maaaring halo-halong kung sila ay nabuo ng iba't ibang uri ng microorganism, at dalisay kung sila ay kinakatawan ng isang uri lamang ng bakterya.

Kung nutritionalIsang cell lamang ang inilalagay sa daluyan, at ang isang pangkat ng mga indibidwal ay nakuha bilang isang resulta ng pagpaparami nito, kung gayon ang hanay ng mga microorganism na ito ay tinatawag na isang clone. Kapag ang isang clone ay nabuo hanggang sa punto kung saan ito ay nakikita ng mata, ang koleksyon ng bacteria na ito ay tinatawag na isang kolonya.

Karaniwan ang paglilinang ng bacteria na nakahiwalay sa iba't ibang pinagmumulan ay isinasagawa nang hiwalay sa isa't isa. Ang bawat hiwalay na lumaki na grupo ng mga mikrobyo ay tinatawag na strain. Kaya, kung ang isang uri ng staphylococcus ay nahiwalay sa tatlong pinagmumulan (o iba't ibang bahagi ng parehong produkto, iba't ibang tao), pinag-uusapan nila ang tungkol sa tatlong strain ng ganitong uri ng staphylococcus.

Mga Salik sa Paglago ng Bakterya

Kabilang dito ang iba't ibang amino acid, lipid, purine base at iba pang mga compound na kinakailangan para sa pagbuo ng mga microorganism. Ang ilang mga mikrobyo ay maaaring independiyenteng makagawa ng mga sangkap na kailangan nila, habang ang iba ay kailangang tanggapin ang mga ito sa tapos na anyo. Ayon sa mga pangangailangan ng mga microorganism sa ilang mga kadahilanan ng paglago, ang pagkilala at pagkita ng kaibhan ng bakterya ay isinasagawa. Gayundin, mahalaga ang parameter na ito para sa tamang paghahanda ng isang nutrient medium para sa laboratoryo at biotechnological na gawain:

• Mga amino acid. Ang bakterya ay maaaring mangailangan ng isang partikular na amino acid o grupo ng mga acid. Kaya, ang clostridia ay nangangailangan ng leucine at tyrosine, ang streptococci ay nangangailangan ng leucine at arginine. Ang mga mikroorganismo na nangangailangan ng mga amino acid mula sa labas upang lumaki ay tinatawag na auxotrophs.
• Purine at pyrimidine base, pati na rin ang kanilang mga derivatives (adenine, guanine at iba pa). Sila ay isang mahalagang kadahilanan sa paglago ng maramiStreptococcus species.
• Mga Bitamina. Ang mga ito ay bahagi ng mga coenzymes na kinakailangan ng bacteria. Kaya, ang nicotinic acid, pati na rin ang amide nito, na bahagi ng NAD at NADP, ay kailangan ng diphtheria at shigella corynebacteria. Ang Thiamine, bilang isang mahalagang bahagi ng pyrophosphate, ay kinakailangan ng Staphylococcus aureus, pneumococcus, brucella. Ang Pantothenic acid, na bahagi ng CoA coenzyme, ay kinakailangan ng tetanus bacilli at ilang uri ng streptococcus. Ang mga cytochrome, at samakatuwid ang folic acid, hemes at biotin na bumubuo sa kanila, ay kinakailangan para sa Mycobacterium tuberculosis at Haemophilus influenzae.

Mga Kinakailangan sa Kapaligiran

Mga kundisyon para sa culture media para sa pag-culture ng bacteria:

1. Nutrisyon. Dapat silang maglaman ng mga sangkap, bukod pa rito, sa isang madaling natutunaw na anyo, na kinakailangan para sa mga mikroorganismo na magpakain at maglagay muli ng enerhiya. Kabilang dito ang mga organogen at mineral. Ang ilang microorganism ay nangangailangan din ng mga bitamina at amino acid na hindi nila ma-synthesize.
2. Optimal na antas ng pH. Nakakaapekto ito sa pagkamatagusin ng lamad ng cell at, nang naaayon, ang kakayahang sumipsip ng mga sustansya ng bacterium. Kadalasan, ang halaga ng pH ay dapat na nasa antas ng 7, 2–7, 4. Maraming mga microorganism sa kurso ng kanilang buhay ang gumagawa ng mga produkto na may acidic o alkaline na mga reaksyon, at upang ang pH ng nutrient medium ay hindi magbago, dapat itong i-buffer.
3. Isotonic. Ang osmotic pressure sa nutrient medium para sa paglilinang ng bakterya ay dapat magkaroon ng parehong mga halaga tulad ngsa loob ng microbial cells. Karaniwan itong tumutugma sa isang 0.5% NaCl solution.
4. Sterility. Ito ay dahil sa ang katunayan na ang paglitaw ng mga banyagang bakterya ay papangitin ang mga resulta ng pag-aaral ng nasuri na strain.
5. Antas ng kahalumigmigan. Ang indicator na ito, kasama ang consistency ng medium, ay dapat magkaroon ng pinakamainam na katangian para sa isang partikular na uri ng bacteria.
6. Potensyal na redox (RH2). Ipinapakita nito ang ratio ng mga sangkap na nag-donate at tumatanggap ng mga electron, pati na rin ang antas ng oxygen saturation ng nutrient medium. Para sa mga aerobes at anaerobes, ang mga kondisyon para sa paglinang ng bakterya ay medyo naiiba sa tagapagpahiwatig na ito. Ang mga anaerobic microorganism ay pinakamahusay na nagpaparami sa mga halaga ng RH2 na mas mababa sa 5 at ang mga aerobic microorganism ay hindi bababa sa 10.
7. Pagkakatulad. Mahalaga na ang culture medium ay naglalaman ng pare-parehong dami ng mga indibidwal na sangkap nito. Bilang karagdagan, mas gusto ang mga malinaw na solusyon, na nagpapadali sa pagsubaybay sa paglaki ng pananim o napansin ang kontaminasyon.

Mga uri ng culture media

Ang pagpili ng isang partikular na daluyan para sa lumalagong mga mikroorganismo ay naiimpluwensyahan ng maraming salik, kabilang dito ang mga katangian ng kanilang nutrisyon at ang layunin ng pag-aaral. Ang mga pangunahing tampok na pinagbabatayan ng pag-uuri ng nutrient media ay:

1. Mga bahagi. Ayon sa mga paunang sangkap na ginamit upang lumikha ng substrate, nakikilala nila ang:

• natural, na inihanda mula sa mga produktong hayop o gulay (hal. karne, gatas, prutas) at angkop para sa paglaki ng halo-halongmga pananim;
• semi-synthetic, kung saan ang mga mamahaling natural na produkto ng pagkain ay pinapalitan ng mga produktong hindi pagkain (halimbawa, bone meal, mga namuong dugo), at kung saan ay pinakamainam para sa paglinang ng ilang uri ng bacteria o paghihiwalay ng kanilang mga produktong metabolic mula sa kapaligiran;

Ang

• synthetic, na inihanda mula sa tumpak na dami ng mga compound ng kemikal, ay may kilalang pare-parehong komposisyon at madaling muling gawin.

2. Consistency (densidad). Pagkilala sa mga kapaligiran:

• likido;
• siksik;
• semi-liquid.

Ang huling dalawa ay inihanda mula sa mga espesyal na solusyon o likidong sangkap na may pagdaragdag ng agar-agar o gelatin upang lumikha ng kinakailangang density. Bilang karagdagan, ang isang siksik na kapaligiran para sa paglaki ng bakterya ay namuong dugo serum, patatas, silica gel media, carrageenan.

3. Tambalan. Sa batayan na ito, ang mga kapaligiran ay:

• simple, ang listahan kung saan ay maikli ay Meat Peptone Broth (MBB), Hottinger Broth and Agar, Meat Peptone Agar (MPA), nutrient gelatin at peptone water.
• complex, na inihanda mula sa mga simple na may dagdag na dugo, whey, carbohydrates at iba pang substance.

4. appointment. Ang mga sumusunod na nutrient media ay nakikilala:

• pangunahing ginagamit sa pagpapalago ng maraming pathogenic microbes (karaniwan ay simpleng komposisyon);
• ang mga espesyal ay ginagamit upang ihiwalay at linangin ang mga bacteria na hindi tumutubo sa mga simpleng substrate;

Ang

• selective (sila rin ay pumipili) ay angkop para sa paghihiwalay ng isang partikular na uri ng bakterya at pagbawalan ang paglaki ng mga nauugnay na mikrobyo (selectivitynilikha sa pamamagitan ng pagdaragdag ng ilang partikular na substance sa media, tulad ng mga antibiotic o s alts, o sa pamamagitan ng pagsasaayos ng pH);

Ginagawang posible ng

• differential diagnostics na makilala ang isang uri ng bacteria mula sa iba sa pamamagitan ng pagtatasa sa aktibidad ng enzymatic, halimbawa, ng medium;

Kailangan ng

• mga preservative para sa paunang inoculation na may kasunod na pagdadala ng mga sample, dahil pinipigilan ng mga ito ang pagkamatay ng mga microorganism, at pinipigilan din ang paglaki ng iba pang bacteria.

Paghahanda ng media

Ang pinakamahalagang hakbang sa paglilinang ng anaerobic bacteria ay ang paghahanda ng angkop na nutrient medium. Pagkatapos mapili ang pinakamainam na mga parameter, magpatuloy sa mga sumusunod na yugto:

• pagtimbang, sa pamamagitan ng pagpili ng sample ng mga bahagi sa isang analytical na balanse;
• dissolution na isinasagawa sa distilled water na pinainit hanggang 70 ° C, at ang mga phosphate, micro- at macros alts ay hiwalay na natutunaw;
• kumukulo sa isang paliguan ng tubig sa loob ng dalawang minuto;
• pagtukoy ng pH sa pamamagitan ng indicator paper o potentiometer;
• pagsala sa pamamagitan ng basang tela o mga filter ng papel para sa likido gayundin sa molten dense media, at sa pamamagitan ng cotton-gauze filter para sa agar media;
• pagbobotohang isinagawa sa 3/4 na kapasidad;
• medium dependent sterilization;
• ang kontrol para sa sterility ay isinasagawa sa pamamagitan ng pag-aayos ng dalawang araw sa isang thermostat, na sinusundan ng pagtingin;
• chemical control upang maitaguyod ang pH at nilalaman ng kinakailanganmga item;
• biological control sa pamamagitan ng trial inoculation.

Isterilisasyon ng glassware at media

Isa sa mga pangunahing prinsipyo ng bacterial cultivation ay sterility. Ang paglaki at pag-unlad ng mga dayuhang microorganism ay maaaring makaapekto sa mga katangian ng nutrient medium sa pamamagitan ng pagbabago ng kemikal na komposisyon at pH nito. Ang sterilization ay ang pangunahing kondisyon para sa pagpapalago ng mga dalisay na kultura. Sa pagsasagawa, ang terminong ito ay nangangahulugan ng mga paraan ng pagkasira ng ganap na lahat ng mga anyo ng buhay sa ibabaw at sa dami ng mga isterilisadong bagay. Ang mga sisidlan, mga instrumentong ginamit, media, at iba pang mga bagay na ginamit sa panahon ng pag-aaral ay isterilisado.

Ilang uri ng isterilisasyon:

• Pag-aapoy. Ang sterilization ng mga loop at needles para sa seeding, glass slide, ilang instrumento ay maaaring isagawa gamit ang burner o spirit lamp.
• Pagkukulo. Angkop para sa paghawak ng mga syringe, karayom, pagkain, ngunit hindi pumapatay ng mga bacterial spores.
• Dry heat sterilization. Isinasagawa ito sa isang espesyal na drying cabinet at angkop para sa pagpoproseso ng mga flasks, test tube at iba pang laboratoryo na babasagin.
• Steam sterilization. Isinasagawa sa isang autoclave, ang pamamaraang ito ay lubos na epektibo. Ngunit hindi ito angkop para sa nutrient media na naglalaman ng mga protina o anumang iba pang mga compound na bumabagsak sa mataas na temperatura. Ang mas matitipid ay matatawag na tyndalization. Isinasagawa ito sa Koch Boiler at pinagsasama ang pagtubo ng mga spores sa kanilang pagkasira.
• Pasteurization. Ginagamit ito para sa media na nagbabago ng kanilang mga katangian kapag pinakuluan (halimbawa, gatas, alak, serbesa), kayaalisin ang mga ito ng mga non-spore-bearing microorganisms. Ang temperatura ng pagpoproseso ay 50-60 ° C lamang sa loob ng labinlimang hanggang tatlumpung minuto. Sa ilang mga kaso, ginagamit ang malamig na isterilisasyon, na isinasagawa gamit ang mga filter o UV ray.

Kondisyon sa paglilinang ng bakterya

Ang paglaki at pag-unlad ng bacteria ay posible lamang sa ilalim ng ilang partikular na salik at ang halaga ng bawat isa sa kanila:

1. Temperatura. May tatlong grupo ng bacteria na naiiba sa mga kagustuhan sa temperatura:

• thermophiles, o heat-loving microbes, ay lumalaki sa 45-90°C, na nangangahulugang hindi sila dumami sa mga organismo ng tao at hayop;

Ang

• psychrophile, o cold-loving microorganism, ay mas gusto ang mga temperatura sa hanay na 5-15 ° C at itinatanim sa malamig na mga tindahan;
• mesophiles, nabubuo sa temperaturang 25-37 ° C, kasama nila ang karamihan ng bacteria.

2. Liwanag. Ito ay isang tampok ng paglilinang ng phototrophic bacteria, dahil isinasagawa nila ang proseso ng photosynthetic. Ngunit para sa karamihan ng mga mikrobyo, ang pag-iilaw ay hindi isang kinakailangan. At kahit na sa kabaligtaran, maaaring pigilan ng solar ultraviolet ang kanilang pag-unlad.

3. Tubig. Ang lahat ng microorganism ay nangangailangan ng tubig sa isang naa-access (likido) na anyo. Iyon ang dahilan kung bakit ang frozen food ay may kaunti o walang paglaki ng bacteria.

4. Kaasiman ng kapaligiran. Ang prinsipyong ito ng paglinang ng bakterya ay tinalakay nang detalyado sa itaas.

5. Pagpapahangin. Ang oxygen, bilang isang kemikal na elemento, ay isang mahalagang bahagi ng tubig at isang malaking bilang ng mga compound na ginagamit para sapaglilinang ng mga mikroorganismo. Ang gaseous oxygen ay maaari ding mapaloob sa tubig at iba pang likido sa dissolved form. Ang isang makabuluhang bahagi ng bakterya ay nangangailangan ng patuloy na supply ng mga molekula ng oxygen. Ngunit para sa isang bilang ng mga mikroorganismo, ito ay hindi kailangan, o, mas masahol pa, ang gas na oxygen ay nakakalason sa kanila, dahil wala silang catalase at peroxidase, na sumisira sa mga nakakalason na produkto sa paghinga. Samakatuwid, ang pinakamahalagang hakbang sa paglilinang ng anaerobic bacteria ay ang pag-alis ng O₂ molecules mula sa nutrient medium.

6. Paglilinang ng mga mikroorganismo. Ang paglilinang ng aerobic at anaerobic bacteria ay isinasagawa sa iba't ibang layer ng kapaligiran at sa iba't ibang mode.

Paglilinang ng mga aerobic microorganism

Ang paglilinang ng aerobic bacteria ay nangangailangan ng molecular oxygen. Upang makakuha ng mga purong kultura ng aerobes na maaaring matagumpay na magamit sa medisina at industriya ng pagkain, ang mga sumusunod na pamamaraan ay ginagamit:

• surface na lumalaki sa siksik na media o sa likidong media (ang kanilang manipis na layer) kapag ang oxygen ay direktang nagmumula sa hangin;
• deep cultivation sa liquid media, kapag ang pagtaas ng dami ng oxygen na natunaw sa mga ito ay nakakamit sa pamamagitan ng patuloy na aeration.

Paglilinang ng mga anaerobic microorganism

Ang pangunahing prinsipyo ng paglinang ng bakterya ng ganitong uri ay ang kanilang minimal na kontak sa atmospheric oxygen. Ang pagbibigay ng mga kondisyon para sa kanilang paglaki ay mas mahirap kaysa sa mga aerobes. Ang mga sumusunod na pamamaraan ay ginagamit upang ihiwalay ang mga anaerobes mula sa molecular O₂:

1. Pisikal. Ang pamamaraang ito ng paglilinang ng anaerobic bacteria ay nabawasan sa kanilang paglilinang sa isang espesyal na vacuum apparatus - isang microanaerostat. Ang hangin sa loob nito ay pinapalitan ng espesyal na gas mixture ng nitrogen na may pagdaragdag ng 10% hydrogen at 5% carbon dioxide.
2. Kemikal. Kabilang dito ang: paggamit ng mga absorbing agent (hal. Fe, Na₂S₂O₄, CuCl) o mga ahente ng pagbabawas (gaya ng ascorbic acid).
3. Biological. Bumaba ito sa co-cultivation ng aerobes at anaerobes sa isang closed system. Ang pamamaraang ito ng paglilinang ng bakterya ay kinabibilangan ng pagtatanim ng kalahati ng isang Petri dish na may ilan sa mga aerobic species ng bakterya, at ang isa pang kalahati ay may pinag-aralan na anaerobe. Magsisimula ang pag-unlad nito sa sandaling naubos na ang lahat ng oxygen.

Ang mga sumusunod na paraan ng pagtatanim ay angkop para sa paglinang ng anaerobic bacteria:

• sa ibabaw na layer;
• sa ibabaw na layer na puno ng sterile paraffin;
• sa kakapalan ng isang siksik na nutrient medium;
• sa malalalim na layer ng viscous media.

Pagkamit ng purong kultura

Ang mga microbiologist ay karaniwang gumagawa ng mga sample na tinitirhan ng maraming iba't ibang uri ng microbes. Gayunpaman, upang matukoy ang sistematikong posisyon ng mga microorganism (pamilya, genus, species), pati na rin pag-aralan ang kanilang mga katangian, kinakailangan na ihiwalay ang mga ito at palaguin ang isang purong kultura. Malaki ang kahalagahan ng mga ito sa maraming industriya ng pagkain, halimbawa, keso, tinapay, kvass, alak, atbp. Ang paglilinang ng lactic acid bacteria ay ginagawang posible na makakuha ngisang mahalagang sangkap para sa paggawa ng mga produktong fermented milk, dough, cocoa, silage at kahit plastic.

Ang paraan ng paghihiwalay ng purong kultura sa isang siksik na daluyan ay batay sa mekanikal na paghihiwalay ng mga selula ng microorganism sa kanilang kasunod na nakahiwalay na paglilinang. Ang sample ay inilipat sa isang sterile volume ng tubig o asin (volume 10-100 ml) at pagkatapos ay inalog ng dalawang minuto. Upang ma-extract ang mga microorganism na matatagpuan sa kapal ng materyal na pinag-aaralan (halimbawa, mga sausage o keso), unang ginanap ang mga sample na piraso gamit ang mga sterile na instrumento na may buhangin. Ang materyal na sumailalim sa paunang paghahanda, na tumitimbang ng 1 g o isang dami ng 1 ml, ay natunaw ng sterile na tubig ng 10, 100, 1000, atbp. Pinipili ang antas ng dilution na nagbibigay ng konsentrasyon ng mga cell na naaayon sa mga kakayahan ng pamamaraan.

Ang kasunod na paglilinang ng mga mikroorganismo ay upang maghanda ng nutrient medium. Karaniwan ang isang siksik na daluyan (MPA) ay pinili. Ito ay unang natunaw at pinalamig sa 45-50 °C, at pagkatapos lamang ito ay ibinuhos sa ilang mga Petri dish (tatlo hanggang limang piraso), sa ilalim kung saan ang mga pamunas mula sa pagsubok na substansiya ng iba't ibang mga konsentrasyon ay inilalagay. Susunod, ang paghahalo ng hindi pa rin frozen na nutrient medium at ang materyal na ipinasok dito ay isinasagawa. Ganito ang pag-aayos ng mga cell sa iba't ibang punto sa volume ng substrate.

Susunod, inilalagay ang mga Petri dish sa thermostat sa loob ng 2 araw sa 22 °C. Sa panahong ito, ang mga selula ay dumami hanggang sa isang lawak na ang kolonya na nabuo ng bawat isa sa mga selula ay nakikita ng mata. Ang bawat isa sa kanila ay isang purong kultura ng uri ng bakterya kung saan nagmula ang mga selula nitorosas.

Pagkatapos nito, mula sa mga Petri dish, ang mga mikroorganismo ay isinasa-subculture sa magkakahiwalay na test tube na puno ng nutrient medium. Sa ganitong paraan, ang mga purong kultura ay nahiwalay sa isang halo-halong sample. Ang pamamaraang ito ay nagtataglay ng pangalan ng developer nito - R. Koch. Ito rin ay karaniwang tinatawag na paraan ng tasa, o nakakaubos ng paghahasik. Pagkatapos makakuha ng mga purong kultura ng iba't ibang uri ng bacteria, ang kanilang hugis, spores, at pamilya ay natutukoy.

Ang lahat ng gawain ay dapat isagawa ayon sa mga prinsipyo ng asepsis. Upang maiwasan ang napaaga na pag-unlad ng mga microorganism, ang pag-aaral ay dapat isagawa kaagad pagkatapos ng sampling. Ang tubig sa gripo ay sinusuri pagkatapos maubos ang mga unang bahagi, dahil maaaring naglalaman ang mga ito ng mga mikrobyo na naipon sa mga tubo at gripo. Ang microflora ng mga prutas, berry at gulay ay pangunahing matatagpuan sa ibabaw (peel), samakatuwid, ang mga paghuhugas ay isinasagawa mula dito. Upang gawin ito, ilagay ang fetus sa isang sterile na lalagyan at punan ito ng kinakailangang dami ng tubig. Pagkatapos ang mga ito ay inalog nang husto at ang tubig ay ibinuhos sa isa pang lalagyan. Ang mga pananim mula sa mga produktong tela ay nakukuha din sa mga pamunas, ngunit bago pa man, ang mga piraso ng isang partikular na sukat ay pinutol mula sa mga ito.