Ang Protein ay isang mahalagang bahagi ng lahat ng organismo. Ang bawat molekula nito ay binubuo ng isa o higit pang polypeptide chain na binubuo ng mga amino acid. Bagama't ang impormasyong kailangan para sa buhay ay naka-encode sa DNA o RNA, ang mga recombinant na protina ay gumaganap ng malawak na hanay ng mga biological function sa mga organismo, kabilang ang enzymatic catalysis, proteksyon, suporta, paggalaw, at regulasyon. Ayon sa kanilang mga pag-andar sa katawan, ang mga sangkap na ito ay maaaring nahahati sa iba't ibang mga kategorya, tulad ng mga antibodies, enzymes, structural component. Dahil sa kanilang mahahalagang pag-andar, ang mga naturang compound ay masinsinang pinag-aralan at malawakang ginagamit.
Noon, ang pangunahing paraan para makakuha ng recombinant na protina ay ang paghiwalayin ito sa isang natural na pinagmumulan, na kadalasang hindi epektibo at nakakaubos ng oras. Ang mga kamakailang pagsulong sa biological molecular na teknolohiya ay naging posible na i-clone ang DNA encoding ng isang partikular na hanay ng mga substance sa isang expression vector para sa mga substance gaya ng bacteria, yeast, insect cell, at mammalian cells.
Sa madaling salita, ang mga recombinant na protina ay isinasalin ng mga exogenous na produkto ng DNA samga buhay na selula. Ang pagkuha sa mga ito ay karaniwang may kasamang dalawang pangunahing hakbang:
- Pag-clone ng molekula.
- Protein expression.
Sa kasalukuyan, ang paggawa ng naturang istraktura ay isa sa pinakamakapangyarihang pamamaraan na ginagamit sa medisina at biology. Ang komposisyon ay may malawak na aplikasyon sa pananaliksik at bioteknolohiya.
Medikal na direksyon
Ang mga recombinant na protina ay nagbibigay ng mahahalagang paggamot para sa iba't ibang sakit tulad ng diabetes, cancer, mga nakakahawang sakit, hemophilia at anemia. Ang mga karaniwang formulasyon ng naturang mga sangkap ay kinabibilangan ng mga antibodies, hormones, interleukins, enzymes, at anticoagulants. Mayroong lumalaking pangangailangan para sa mga recombinant formulation para sa therapeutic na paggamit. Pinapayagan ka nitong palawakin ang mga paraan ng paggamot.
Ang genetically engineered recombinant proteins ay gumaganap ng mahalagang papel sa therapeutic drug market. Ang mga mammal na selula ay kasalukuyang gumagawa ng pinakamaraming panterapeutika na ahente dahil ang kanilang mga pormulasyon ay may kakayahang gumawa ng mataas na kalidad, natural-like substance. Bilang karagdagan, maraming inaprubahang recombinant therapeutic proteins ang ginawa sa E. coli dahil sa magandang genetika, mabilis na paglaki, at mataas na produktibidad. Mayroon din itong positibong epekto sa pagbuo ng mga gamot batay sa sangkap na ito.
Pananaliksik
Ang pagkuha ng mga recombinant na protina ay batay sa iba't ibang paraan. Ang mga sangkap ay nakakatulong upang malaman ang mga pangunahing at pangunahing prinsipyo ng katawan. Ang mga molekulang ito ay maaaring gamitin upang makilala at matukoylokasyon ng substance na na-encode ng isang partikular na gene, at upang ipakita ang paggana ng ibang mga gene sa iba't ibang aktibidad ng cellular tulad ng cell signaling, metabolismo, paglaki, pagtitiklop at pagkamatay, transkripsyon, pagsasalin at pagbabago ng mga compound na tinalakay sa artikulo.
Kaya, ang naobserbahang komposisyon ay kadalasang ginagamit sa molecular biology, cell biology, biochemistry, structural at biophysical na pag-aaral at marami pang ibang larangan ng agham. Kasabay nito, ang pagkuha ng mga recombinant na protina ay isang internasyonal na kasanayan.
Ang mga naturang compound ay mga kapaki-pakinabang na tool sa pag-unawa sa intercellular interaction. Napatunayang epektibo ang mga ito sa ilang mga pamamaraan sa laboratoryo tulad ng ELISA at immunohistochemistry (IHC). Maaaring gamitin ang mga recombinant na protina upang bumuo ng mga pagsusuri sa enzyme. Kapag ginamit kasabay ng isang pares ng naaangkop na antibodies, maaaring gamitin ang mga cell bilang mga pamantayan para sa mga bagong teknolohiya.
Biotechnology
Ang mga recombinant na protina na naglalaman ng sequence ng amino acid ay ginagamit din sa industriya, produksyon ng pagkain, agrikultura at bioengineering. Halimbawa, sa pag-aalaga ng hayop, maaaring magdagdag ng mga enzyme sa pagkain upang mapataas ang nutritional value ng mga sangkap ng feed, mabawasan ang mga gastos at basura, suportahan ang kalusugan ng bituka ng hayop, mapabuti ang pagiging produktibo, at mapabuti ang kapaligiran.
Sa karagdagan, ang lactic acid bacteria (LAB) sa mahabang panahonay ginamit upang makagawa ng mga fermented na pagkain, at kamakailan ay binuo ang LAB para sa pagpapahayag ng mga recombinant na protina na naglalaman ng isang sequence ng amino acid, na maaaring malawakang gamitin, halimbawa, upang mapabuti ang pantunaw ng tao, hayop at nutritional.
Gayunpaman, ang mga sangkap na ito ay may mga limitasyon din:
- Sa ilang mga kaso, ang paggawa ng mga recombinant na protina ay kumplikado, magastos at matagal.
- Ang mga sangkap na ginawa sa mga cell ay maaaring hindi tumugma sa mga natural na anyo. Ang pagkakaibang ito ay maaaring mabawasan ang pagiging epektibo ng mga therapeutic recombinant na protina at maging sanhi ng mga side effect. Bilang karagdagan, ang pagkakaibang ito ay maaaring makaapekto sa mga resulta ng mga eksperimento.
- Ang pangunahing problema sa lahat ng recombinant na gamot ay immunogenicity. Ang lahat ng produktong biotech ay maaaring magpakita ng ilang uri ng immunogenicity. Mahirap hulaan ang kaligtasan ng mga bagong therapeutic protein.
Sa pangkalahatan, ang mga pagsulong sa biotechnology ay tumaas at pinadali ang paggawa ng mga recombinant na protina para sa iba't ibang mga aplikasyon. Bagama't mayroon pa rin silang mga kakulangan, ang mga sangkap ay mahalaga sa medisina, pananaliksik at biotechnology.
Link ng sakit
Ang recombinant na protina ay hindi nakakapinsala sa mga tao. Ito ay isang mahalagang bahagi lamang ng kabuuang molekula sa pagbuo ng isang partikular na gamot o nutritional element. Maraming mga medikal na pag-aaral ang nagpakita na ang sapilitang pagpapahayag ng protina ng FGFBP3 (dinaglat na BP3) sa isang laboratoryo na strain ng napakataba na mga daga ay nagpakita ng makabuluhang pagbawas sa kanilang taba sa katawan.masa, sa kabila ng genetic predisposition na gagamitin.
Ang mga resulta ng mga pagsubok na ito ay nagpapakita na ang FGFBP3 protein ay maaaring mag-alok ng bagong therapy para sa mga karamdamang nauugnay sa metabolic syndrome tulad ng type 2 diabetes at fatty liver disease. Ngunit dahil ang BP3 ay isang natural na protina at hindi isang artipisyal na gamot, ang mga klinikal na pagsubok ng recombinant na BP3 ng tao ay maaaring magsimula pagkatapos ng huling round ng preclinical na pag-aaral. Sa, iyon ay, may mga dahilan na nauugnay sa kaligtasan ng pagsasagawa ng mga naturang pag-aaral. Ang recombinant na protina ay hindi nakakapinsala sa mga tao dahil sa sunud-sunod na pagproseso at paglilinis nito. Nagaganap din ang mga pagbabago sa antas ng molekular.
Ang PD-L2, isa sa mga pangunahing manlalaro sa immunotherapy, ay hinirang para sa 2018 Nobel Prize sa Physiology o Medicine. Ang gawaing ito, na sinimulan ni Prof. James P. Allison mula sa USA at Prof. Tasuku Honjo mula sa Japan, ay humantong sa paggamot ng mga kanser tulad ng melanoma, kanser sa baga, at iba pa batay sa checkpoint immunotherapy. Kamakailan, ang AMSBIO ay nagdagdag ng isang pangunahing bagong produkto sa immunotherapy line nito, ang PD-L2/TCR activator - CHO Recombinant Cell Line.
Sa proof-of-concept na mga eksperimento, ang mga mananaliksik sa University of Alabama sa Birmingham, pinangunahan ni H. Long Zheng, MD, Propesor Robert B. Adams, at Direktor ng Laboratory Medicine, Department of Pathology, UAB School of Ang gamot, ay nag-highlight ng isang potensyal na therapy isang bihira ngunit nakamamatay na sakit sa pagdurugo, TTP.
Ang mga resulta nitoIpinakita ng mga pag-aaral sa unang pagkakataon na ang pagsasalin ng rADAMTS13-loaded platelets ay maaaring isang nobela at potensyal na epektibong therapeutic approach para sa arterial thrombosis na nauugnay sa congenital at immune-mediated TTP.
Ang recombinant na protina ay hindi lamang isang nutrient, kundi isang gamot din sa komposisyon ng gamot na binuo. Ito ay ilan lamang sa mga lugar na ngayon ay kasangkot sa medisina at may kaugnayan sa pag-aaral ng lahat ng mga elemento ng istruktura nito. Gaya ng ipinapakita ng internasyonal na kasanayan, ginagawang posible ng istruktura ng isang substansiya sa antas ng molekular na harapin ang maraming seryosong problema sa katawan ng tao.
Pagbuo ng bakuna
Ang recombinant na protina ay isang partikular na hanay ng mga molekula na maaaring imodelo. Ang isang katulad na ari-arian ay ginagamit sa pagbuo ng mga bakuna. Ang isang bagong diskarte sa pagbabakuna, na kilala rin bilang ang paggamit ng isang espesyal na recombinant virus injection, ay maaaring maprotektahan ang milyun-milyong manok na nasa panganib mula sa isang malubhang sakit sa paghinga, sinabi ng mga mananaliksik mula sa Unibersidad ng Edinburgh at Pirbright Institute. Gumagamit ang mga bakunang ito ng hindi nakakapinsala o mahinang mga bersyon ng isang virus o bacterium upang ipasok ang mga mikrobyo sa mga selula ng katawan. Sa kasong ito, ginamit ng mga eksperto ang mga recombinant na virus na may iba't ibang spike protein bilang mga bakuna upang lumikha ng dalawang bersyon ng hindi nakakapinsalang virus. Maraming iba't ibang gamot na binuo sa koneksyon na ito.
Recombinant protein trade name at analogues ay ang mga sumusunod:
- "Fortelizin".
- "Z altrap".
- "Eylea".
Ang mga ito ay pangunahing mga gamot na anticancer, ngunit may iba pang bahagi ng paggamot na nauugnay sa aktibong sangkap na ito.
Ang isang bagong bakuna, na tinatawag ding LASSARAB, na idinisenyo upang protektahan ang mga tao laban sa lagnat na Lassa at rabies, ay nagpakita ng magagandang resulta sa mga preclinical na pag-aaral, ayon sa isang bagong pag-aaral na inilathala sa siyentipikong journal na Nature Communications. Gumagamit ng mahinang rabies virus ang isang inactivated recombinant vaccine candidate.
Inilagay ng research team ang genetic material ng Lassa virus sa isang rabies virus vector upang ang bakuna ay magpahayag ng mga surface protein sa parehong Lassa at rabies cell. Ang mga compound na ito sa ibabaw ay nagdudulot ng immune response laban sa mga nakakahawang ahente. Ang bakunang ito ay pagkatapos ay inactivate upang "sirain" ang live rabies virus na ginamit upang gawin ang carrier.
Pagkuha ng Mga Paraan
May ilang mga sistema para sa paggawa ng substance. Ang pangkalahatang pamamaraan para sa pagkuha ng isang recombinant na protina ay batay sa pagkuha ng biological na materyal mula sa synthesis. Ngunit may iba pang mga paraan.
Sa kasalukuyan, mayroong limang pangunahing sistema ng pagpapahayag:
- E. coli expression system.
- Yeast expression system.
- Insect cell expression system.
- Mammalian cell expression system.
- Cell-free na sistema ng pagpapahayag ng protina.
Ang huling opsyon ay partikular na angkop para sa pagpapahayag ng mga transmembrane proteinat mga nakakalason na compound. Sa mga nagdaang taon, ang mga sangkap na mahirap ipahayag sa pamamagitan ng maginoo na mga intracellular na pamamaraan ay matagumpay na naisama sa mga cell sa vitro. Sa Belarus, ang produksyon ng mga recombinant na protina ay malawakang ginagamit. Mayroong ilang mga negosyong pag-aari ng estado na tumatalakay sa isyung ito.
Ang Cell Free Protein Synthesis System ay isang mabilis at mahusay na paraan para sa pag-synthesize ng mga target na substance sa pamamagitan ng pagdaragdag ng iba't ibang substrate at energy compound na kinakailangan para sa transkripsyon at pagsasalin sa enzymatic system ng mga cellular extract. Sa mga nakalipas na taon, unti-unting lumitaw ang mga bentahe ng cell-free na pamamaraan para sa mga uri ng substance gaya ng masalimuot at nakakalason na lamad, na nagpapakita ng kanilang potensyal na aplikasyon sa larangan ng biopharmaceutical.
Ang Cell-free na teknolohiya ay maaaring magdagdag ng iba't ibang hindi natural na mga amino acid nang madali at sa isang kontroladong paraan upang makamit ang mga kumplikadong proseso ng pagbabago na mahirap lutasin pagkatapos ng conventional recombinant expression. Ang ganitong mga pamamaraan ay may mataas na halaga ng aplikasyon at potensyal para sa paghahatid ng gamot at pagbuo ng bakuna gamit ang mga particle na tulad ng virus. Ang isang malaking bilang ng mga protina ng lamad ay matagumpay na naipahayag sa mga libreng cell.
Expression ng mga komposisyon
Recombinant protein CFP10-ESAT 6 ay ginawa at ginagamit upang gumawa ng mga bakuna. Ang ganitong tuberculosis allergen ay nagpapahintulot sa iyo na palakasin ang immune system at bumuo ng mga antibodies. Sa pangkalahatan, ang mga pag-aaral sa molekular ay kinabibilangan ng pag-aaral ng anumang aspeto ng isang protina, tulad ng istraktura, pag-andar, mga pagbabago, lokalisasyon, o mga pakikipag-ugnayan. Maglakbaykung paano kinokontrol ng mga partikular na substance ang mga panloob na proseso, kadalasang nangangailangan ang mga mananaliksik ng mga paraan upang makagawa ng mga functional compound na interesado at benepisyo.
Dahil sa laki at pagiging kumplikado ng mga protina, ang chemical synthesis ay hindi isang praktikal na opsyon para sa gawaing ito. Sa halip, ang mga buhay na selula at ang kanilang cellular na makinarya ay karaniwang ginagamit bilang mga pabrika upang lumikha at bumuo ng mga sangkap batay sa ibinigay na genetic template. Ang recombinant protein expression system pagkatapos ay bumubuo ng kinakailangang istraktura upang lumikha ng isang gamot. Susunod ay ang pagpili ng kinakailangang materyal para sa iba't ibang kategorya ng mga gamot.
Hindi tulad ng mga protina, ang DNA ay madaling mabuo sa pamamagitan ng synthetic o in vitro gamit ang mahusay na mga recombinant technique. Samakatuwid, ang mga template ng DNA ng mga partikular na gene, na mayroon o walang idinagdag na mga sequence ng reporter o mga sequence ng affinity tag, ay maaaring idisenyo bilang mga template para sa pagpapahayag ng sinusubaybayang substance. Ang mga naturang compound na nagmula sa gayong mga template ng DNA ay tinatawag na mga recombinant na protina.
Ang mga tradisyunal na diskarte para sa pagpapahayag ng isang substance ay kinabibilangan ng paglilipat ng mga cell na may DNA vector na naglalaman ng template at pagkatapos ay pag-culture ng mga cell upang i-transcribe at isalin ang gustong protina. Karaniwan, ang mga cell ay pagkatapos ay lysed upang kunin ang ipinahayag na tambalan para sa kasunod na paglilinis. Ang recombinant protein CFP10-ESAT6 ay pinoproseso sa ganitong paraan at dumadaan sa isang purification system mula sa posiblengang pagbuo ng mga lason. Pagkatapos lamang nito ay i-synthesize ito sa isang bakuna.
Parehong prokaryotic at eukaryotic in vivo expression system para sa mga molekular na substance ay malawakang ginagamit. Ang pagpili ng sistema ay depende sa uri ng protina, ang pangangailangan para sa functional na aktibidad, at ang nais na ani. Kasama sa mga expression system na ito ang mga mammal, insekto, yeast, bacteria, algae at mga cell. Ang bawat system ay may sariling mga pakinabang at hamon, at ang pagpili ng tamang sistema para sa isang partikular na aplikasyon ay mahalaga para sa matagumpay na pagpapahayag ng sangkap na sinusuri.
Expression mula sa mga mammal
Ang paggamit ng mga recombinant na protina ay nagbibigay-daan sa pagbuo ng mga bakuna at gamot sa iba't ibang antas. Para dito, ang pamamaraang ito ng pagkuha ng isang sangkap ay maaaring gamitin. Maaaring gamitin ang mga sistema ng pagpapahayag ng mammalian upang makagawa ng mga protina mula sa kaharian ng mga hayop na may pinakamaraming katutubong istraktura at aktibidad dahil sa kanilang kapaligiran na nauugnay sa pisyolohikal. Nagreresulta ito sa mataas na antas ng post-translational processing at functional na aktibidad. Maaaring gamitin ang mga mammalian expression system upang makagawa ng mga antibodies, kumplikadong protina, at mga compound para gamitin sa mga cell-based na functional assays. Gayunpaman, ang mga benepisyong ito ay kasama ng mas mahigpit na kundisyon sa kultura.
Mammalian expression system ay maaaring gamitin upang makabuo ng mga protina nang pansamantala o sa pamamagitan ng mga stable na linya ng cell kung saan isinama ang expression construct sa host genome. Habang ang mga naturang sistema ay maaaring gamitin sa maraming mga eksperimento, ang orasang produksyon ay maaaring makabuo ng malaking halaga ng substance sa loob ng isa hanggang dalawang linggo. Ang ganitong uri ng recombinant protein biotechnology ay mataas ang demand.
Ang mga transient, high-yielding na mammalian expression system na ito ay gumagamit ng mga suspension culture at maaaring magbunga ng mga gramo bawat litro. Bilang karagdagan, ang mga protina na ito ay may mas maraming katutubong pagtitiklop at mga pagbabago pagkatapos ng pagsasalin tulad ng glycosylation kumpara sa iba pang mga expression system.
Insect Expression
Ang mga pamamaraan para sa paggawa ng recombinant na protina ay hindi limitado sa mga mammal. Mayroon ding mga mas produktibong paraan sa mga tuntunin ng mga gastos sa produksyon, bagama't ang yield ng substance sa bawat 1 litro ng ginagamot na likido ay mas mababa.
Maaaring gamitin ang mga cell ng insekto upang magpahayag ng mataas na antas ng protina na may mga pagbabagong katulad ng mga mammalian system. Mayroong ilang mga sistema na maaaring magamit upang makabuo ng recombinant na baculovirus, na pagkatapos ay magagamit upang kunin ang sangkap na kinaiinteresan sa mga selula ng insekto.
Ang mga expression ng mga recombinant na protina ay madaling mapalaki at maiangkop sa high density suspension culture para sa malakihang pagsasama-sama ng mga molekula. Ang mga ito ay mas functional na katulad sa katutubong komposisyon ng mammalian matter. Bagama't ang ani ay maaaring hanggang 500 mg/L, ang produksyon ng recombinant baculovirus ay maaaring magtagal at ang mga kondisyon ng kultura ay mas mahirap kaysa sa prokaryotic system. Gayunpaman, sa mas timog at mas maiinit na mga bansa, isang katuladang paraan ay itinuturing na mas mahusay.
Bacterial expression
Ang produksyon ng mga recombinant na protina ay maaaring maitatag sa tulong ng bacteria. Ang teknolohiyang ito ay ibang-iba sa mga inilarawan sa itaas. Ang mga bacterial protein expression system ay popular dahil ang bacteria ay madaling ikultura, mabilis na lumaki, at nagbibigay ng mataas na ani ng recombinant formulation. Gayunpaman, ang mga multidomain na eukaryotic substance na ipinahayag sa bacteria ay kadalasang hindi gumagana dahil ang mga cell ay hindi nilagyan ng mga kinakailangang post-translational modification o molecular folding.
Sa karagdagan, maraming mga protina ang nagiging hindi matutunaw bilang mga molekula ng pagsasama, na napakahirap na mabawi nang walang malupit na mga denaturator at kasunod na masalimuot na mga pamamaraan sa pag-refold ng molekular. Ang paraang ito ay kadalasang itinuturing na higit sa lahat ay pang-eksperimento.
Cell free expression
Recombinant protein na naglalaman ng amino acid sequence ng staphylokinase ay nakukuha sa bahagyang naiibang paraan. Kasama ito sa maraming uri ng mga iniksyon, na nangangailangan ng ilang system bago gamitin.
Ang Cell free protein expression ay isang in vitro synthesis ng isang substance gamit ang translationally compatible whole cell extracts. Sa prinsipyo, ang buong cell extract ay naglalaman ng lahat ng macromolecules at mga bahagi na kinakailangan para sa transkripsyon, pagsasalin, at maging pagkatapos ng translational na pagbabago.
Ang mga bahaging ito ay kinabibilangan ng RNA polymerase, regulatory protein factor, transcription form, ribosome at tRNA. Kapag nagdadagdagmga cofactor, nucleotides at isang partikular na template ng gene, ang mga extract na ito ay maaaring mag-synthesize ng mga protina na interesado sa loob ng ilang oras.
Bagama't hindi sustainable para sa malakihang produksyon, ang cell-free o in vitro protein expression (IVT) system ay nag-aalok ng ilang mga pakinabang kumpara sa conventional in vivo system.
Ang Cell-free expression ay nagbibigay-daan sa mabilis na synthesis ng mga recombinant formulation nang hindi kinasasangkutan ng cell culture. Ginagawang posible ng mga cell-free system na lagyan ng label ang mga protina na may binagong mga amino acid, pati na rin ang pagpapahayag ng mga compound na sumasailalim sa mabilis na proteolytic degradation ng intracellular protease. Bilang karagdagan, mas madaling ipahayag ang maraming iba't ibang mga protina nang sabay-sabay gamit ang isang cell-free na pamamaraan (halimbawa, pagsubok ng mga mutasyon ng protina sa pamamagitan ng maliit na sukat na pagpapahayag mula sa maraming iba't ibang mga template ng recombinant na DNA). Sa kinatawan ng eksperimentong ito, ginamit ang IVT system para ipahayag ang human caspase-3 protein.
Mga konklusyon at mga prospect sa hinaharap
Recombinant protein production ay makikita na bilang isang mature na disiplina. Ito ang resulta ng maraming incremental improvements sa purification at analysis. Sa kasalukuyan, ang mga programa sa pagtuklas ng droga ay bihirang huminto dahil sa kawalan ng kakayahan na makagawa ng target na protina. Ang magkakatulad na proseso para sa pagpapahayag, paglilinis at pagsusuri ng ilang recombinant substance ay kilala na ngayon sa maraming laboratoryo sa buong mundo.
Protein complex at lumalaking tagumpay sa paggawaAng mga solubilized na istruktura ng lamad ay mangangailangan ng higit pang mga pagbabago upang makasabay sa pangangailangan. Ang paglitaw ng mga epektibong organisasyon sa pagsasaliksik ng kontrata para sa mas regular na supply ng mga protina ay magbibigay-daan sa muling paglalaan ng mga mapagkukunang siyentipiko upang matugunan ang mga bagong hamon na ito.
Dagdag pa rito, ang mga parallel na daloy ng trabaho ay dapat magbigay-daan sa paglikha ng mga kumpletong library ng sinusubaybayang substance upang paganahin ang bagong target na pagkakakilanlan at advanced na screening, kasama ang tradisyonal na maliliit na molekula na mga proyekto sa pagtuklas ng gamot.
