Molecular biological research method ay may malaking papel sa modernong medisina, forensics at biology. Salamat sa mga pagsulong sa pag-aaral ng DNA at RNA, napag-aaralan ng isang tao ang genome ng isang organismo, natutukoy ang sanhi ng isang sakit, nakikilala ang nais na nucleic acid sa pinaghalong acid, atbp.
Molecular biological na pamamaraan ng pananaliksik. Ano ito?
Noong dekada 70 at 80, ang mga siyentipiko sa unang pagkakataon ay nagtagumpay sa pag-decipher ng genome ng tao. Ang kaganapang ito ay nagbigay ng lakas sa pagbuo ng genetic engineering at molecular biology. Ang pag-aaral ng mga katangian ng DNA at RNA ay humantong sa katotohanan na posible na ngayong gamitin ang mga nucleic acid na ito upang masuri ang isang sakit, pag-aralan ang mga gene.
Pagkuha ng DNA at RNA
Molecular biological diagnostic na pamamaraan ay nangangailangan ng pagkakaroon ng panimulang materyal: mas madalas ito ay mga nucleic acid. Mayroong ilang mga paraan upang ihiwalay ang mga sangkap na ito mula sa mga selula ng mga buhay na organismo. Ang bawat isa sa kanila ay may sariling mga pakinabang at disadvantages, at ito ay kinakailanganisaalang-alang kapag pumipili ng paraan para sa paghihiwalay ng mga purong nucleic acid.
1. Pagkuha ng DNA ayon kay Marmur. Ang pamamaraan ay binubuo sa paggamot ng isang pinaghalong mga sangkap na may alkohol, bilang isang resulta kung saan ang purong DNA ay namuo. Ang kawalan ng pamamaraang ito ay ang paggamit ng mga agresibong sangkap: phenol at chloroform.
2. Paghihiwalay ng DNA ayon kay Boom. Ang pangunahing sangkap na ginamit dito ay guanidine thiocyanate (GuSCN). Nag-aambag ito sa pag-ulan ng deoxyribonucleic acid sa mga dalubhasang substrate, kung saan maaari itong makolekta pagkatapos gamit ang isang espesyal na buffer. Gayunpaman, ang GuSCN ay isang inhibitor ng PTC, at kahit isang maliit na bahagi nito na napupunta sa precipitated DNA ay maaaring makaapekto sa kurso ng polymerase chain reaction, na gumaganap ng mahalagang papel sa pagtatrabaho sa mga nucleic acid.
3. Sedimentation ng mga impurities. Ang pamamaraan ay naiiba sa mga nauna dahil hindi ang mga molekula ng deoxyribonucleic acid ang namuo, ngunit ang mga dumi. Upang gawin ito, ginagamit ang mga exchanger ng ion. Ang disadvantage ay hindi lahat ng substance ay maaaring namuo.
4. Mass screening. Ang pamamaraang ito ay ginagamit sa mga kaso kung saan ang eksaktong impormasyon tungkol sa komposisyon ng molekula ng DNA ay hindi kailangan, ngunit ito ay kinakailangan upang makakuha ng ilang istatistikal na data. Ito ay ipinaliwanag sa pamamagitan ng katotohanan na ang istraktura ng nucleic acid ay maaaring masira kapag ginagamot sa mga detergent, lalo na sa alkalis.
Pag-uuri ng mga pamamaraan ng pananaliksik
Lahat ng molecular biological research method ay nahahati sa tatlong malalaking grupo:
1. Amplification (gamit ang maraming enzymes). Ditoay tumutukoy sa PCR - polymerase chain reaction, na gumaganap ng malaking papel sa marami sa mga diagnostic na pamamaraan.
2. Hindi nagpapalakas. Ang pangkat ng mga pamamaraan na ito ay direktang nauugnay sa pagpapatakbo ng mga pinaghalong nucleic acid. Ang mga halimbawa ay 3 blots, in situ hybridization, atbp.
3. Mga pamamaraan batay sa pagkilala ng isang senyales mula sa isang molekula ng probe na nagbubuklod sa isang partikular na DNA o RNA ng probe. Ang isang halimbawa ay ang Hybride Capture System (hc2).
Mga enzyme na magagamit sa molecular biology research method
Maraming molecular diagnostic method ang nagsasangkot ng paggamit ng malawak na hanay ng mga enzyme. Nasa ibaba ang pinakakaraniwang ginagamit:
1. Restriction enzyme - "pinutol" ang molekula ng DNA sa mga kinakailangang bahagi.
2. DNA polymerase - nag-synthesize ng double-stranded molecule ng deoxyribonucleic acid.
3. Reverse transcriptase (revertase) - ginagamit para i-synthesize ang DNA sa isang RNA template.
4. DNA ligase - responsable para sa pagbuo ng mga phosphodiester bond sa pagitan ng mga nucleotide.
5. Exonuclease - inaalis ang mga nucleotide mula sa mga terminal na seksyon ng molekula ng deoxyribonucleic acid.
PCR ang pangunahing paraan ng pagpapalakas ng DNA
Ang Polymerase chain reaction (PCR) ay aktibong ginagamit sa modernong molecular biology. Ito ay isang paraan kung saan ang isang malaking bilang ng mga kopya ay maaaring makuha mula sa isang molekula ng DNA (mga molekula ay pinalaki).
Mga pangunahing function ng PCR:
- diagnosticssakit;
- pag-clone ng mga segment ng DNA, mga gene.
Ang mga sumusunod na elemento ay kinakailangan upang magsagawa ng polymerase chain reaction: ang paunang DNA molecule, isang thermostable DNA polymerase (Taq o Pfu), deoxyribonucleotide phosphates (sources ng nitrogenous bases), primers (2 primers bawat 1 DNA molecule) at ang buffer system mismo, kung saan posible ang lahat ng reaksyon.
Ang PCR ay binubuo ng tatlong hakbang: denaturation, primer annealing at elongation.
1. Denaturasyon. Sa temperatura na 94-95 degrees Celsius, ang mga hydrogen bond sa pagitan ng dalawang strand ng DNA ay nasira, at bilang resulta ay nakakakuha tayo ng dalawang single-stranded na molekula.
2. Pagsusubo ng panimulang aklat. Sa temperaturang 50-60 degrees Celsius, ang mga primer ay nakakabit sa mga dulo ng single-stranded na nucleic acid molecule ayon sa uri ng complementarity.
3. Pagpahaba. Sa temperaturang 72 degrees, nangyayari ang synthesis ng anak na babae na double-stranded molecule ng deoxyribonucleic acid.
DNA sequencing
Molecular biological research method ay madalas na nangangailangan ng kaalaman sa nucleotide sequence sa isang deoxyribonucleic acid molecule. Isinasagawa ang sequencing upang matukoy ang genetic code. Ang mga molekular na diagnostic ng hinaharap ay ibabatay sa kaalamang nakuha mula sa pagkakasunud-sunod ng tao.
Ang mga sumusunod na uri ng sequencing ay nakikilala:
- Pagsusunod-sunod ni Maxam-Gilbert;
- Sanger sequencing;
- pyrosequencing;
- nanoporesequencing.
