Ang pagsipsip at karagdagang muling pagpapalabas ng liwanag ng inorganic at organic na media ay resulta ng phosphorescence o fluorescence. Ang pagkakaiba sa pagitan ng mga phenomena ay ang haba ng agwat sa pagitan ng pagsipsip ng liwanag at paglabas ng stream. Sa fluorescence, ang mga prosesong ito ay nangyayari halos sabay-sabay, at sa phosphorescence, na may ilang pagkaantala.
Makasaysayang background
Noong 1852, unang inilarawan ng British scientist na si Stokes ang fluorescence. Siya ang lumikha ng bagong termino bilang resulta ng kanyang mga eksperimento sa fluorspar, na naglalabas ng pulang ilaw kapag nalantad sa ultraviolet light. Napansin ng Stokes ang isang kawili-wiling kababalaghan. Nalaman niya na ang wavelength ng fluorescent light ay palaging mas mahaba kaysa sa excitation light.
Maraming eksperimento ang isinagawa noong ika-19 na siglo upang kumpirmahin ang hypothesis. Ipinakita nila na ang iba't ibang mga sample ay nag-fluoresce kapag nalantad sa ultraviolet light. Kasama sa mga materyales, bukod sa iba pa, mga kristal, resin, mineral, chlorophyll,panggamot hilaw na materyales, inorganic compounds, bitamina, langis. Ang direktang paggamit ng mga tina para sa biological analysis ay nagsimula lamang noong 1930
Fluorescence microscopy paglalarawan
Ang ilan sa mga materyales na ginamit sa pananaliksik sa unang kalahati ng ika-20 siglo ay lubos na tiyak. Salamat sa mga indicator na hindi makakamit sa pamamagitan ng mga contrast na pamamaraan, ang fluorescence microscopy method ay naging isang mahalagang tool sa parehong biomedical at biological na pananaliksik. Ang mga resultang nakuha ay hindi maliit na kahalagahan para sa mga materyal na agham.
Ano ang mga benepisyo ng fluorescence microscopy? Sa tulong ng mga bagong materyales, naging posible na ihiwalay ang mga partikular na cell at submicroscopic na bahagi. Ang isang fluorescent microscope ay nagbibigay-daan sa iyo upang makita ang mga indibidwal na molekula. Ang iba't ibang mga tina ay nagbibigay-daan sa iyo upang makilala ang ilang mga elemento sa parehong oras. Kahit na ang spatial na resolusyon ng kagamitan ay limitado ng limitasyon ng diffraction, na, sa turn, ay nakasalalay sa mga tiyak na katangian ng sample, ang pagtuklas ng mga molekula sa ibaba ng antas na ito ay posible rin. Ang iba't ibang mga sample ay nagpapakita ng autofluorescence pagkatapos ng pag-iilaw. Ang phenomenon na ito ay malawakang ginagamit sa petrology, botany, semiconductor industry.
Mga Tampok
Ang pag-aaral ng mga tissue ng hayop o mga pathogenic microorganism ay kadalasang kumplikado ng alinman sa masyadong mahina o masyadong malakas na hindi partikular na autofluorescence. Gayunpaman, ang halaga sanakuha ng pananaliksik ang pagpapakilala sa materyal ng mga bahagi na nasasabik sa isang tiyak na haba ng daluyong at nagpapalabas ng isang liwanag na pagkilos ng bagay ng kinakailangang intensity. Ang mga fluorochrome ay kumikilos bilang mga tina na may kakayahang idikit sa sarili sa mga istruktura (hindi nakikita o nakikita). Kasabay nito, nakikilala sila sa pamamagitan ng mataas na selectivity na may kinalaman sa mga target at quantum yield.
Ang
Fluorescence microscopy ay malawakang ginagamit sa pagdating ng natural at synthetic na mga tina. Mayroon silang mga partikular na profile ng emission at excitation intensity at naglalayon sa mga partikular na biological na target.
Pagkilala sa mga indibidwal na molekula
Kadalasan, sa ilalim ng perpektong mga kondisyon, maaari mong irehistro ang glow ng isang elemento. Upang gawin ito, bukod sa iba pang mga bagay, kinakailangan upang matiyak ang sapat na mababang ingay ng detector at optical na background. Ang isang molekula ng fluorescein ay maaaring maglabas ng hanggang 300,000 photon bago masira dahil sa photobleaching. Sa 20% rate ng koleksyon at kahusayan sa proseso, maaari silang mairehistro sa halagang humigit-kumulang 60 thousand
Fluorescence microscopy, batay sa avalanche photodiodes o electron multiplication, ay nagbigay-daan sa mga mananaliksik na obserbahan ang gawi ng mga indibidwal na molekula sa loob ng ilang segundo, at sa ilang pagkakataon ay ilang minuto.
Mga Kahirapan
Ang pangunahing problema ay ang pagsugpo ng ingay mula sa optical background. Dahil sa katotohanan na marami sa mga materyales na ginamit sa pagtatayo ng mga filter at lens ay nagpapakita ng ilang autofluorescence, ang mga pagsisikap ng mga siyentipiko sa mga unang yugto ay nakatuon sa pagpapalabasmga bahagi na may mababang fluorescence. Gayunpaman, ang mga kasunod na eksperimento ay humantong sa mga bagong konklusyon. Sa partikular, natagpuan ang fluorescence microscopy batay sa kabuuang panloob na pagmuni-muni upang makamit ang mababang background at mataas na output ng liwanag ng paggulo.
Mekanismo
Ang mga prinsipyo ng fluorescence microscopy batay sa kabuuang panloob na pagmuni-muni ay ang paggamit ng mabilis na nabubulok o hindi nagpapalaganap na alon. Lumilitaw ito sa interface sa pagitan ng media na may iba't ibang mga indeks ng repraktibo. Sa kasong ito, ang light beam ay dumadaan sa isang prisma. Mayroon itong mataas na refractive index.
Ang prisma ay katabi ng isang may tubig na solusyon o mababang parameter na salamin. Kung ang sinag ng liwanag ay nakadirekta dito sa isang anggulo na mas malaki kaysa sa kritikal, ang sinag ay ganap na makikita mula sa interface. Ang hindi pangkaraniwang bagay na ito, sa turn, ay nagdudulot ng isang hindi nagpapalaganap na alon. Sa madaling salita, nabuo ang isang electromagnetic field na tumatagos sa medium na may mas mababang refractive index sa layong mas mababa sa 200 nanometer.
Sa isang non-propagating wave, ang intensity ng liwanag ay magiging sapat na upang pukawin ang mga fluorophores. Gayunpaman, dahil sa napakababaw na lalim nito, magiging napakaliit ng volume nito. Ang resulta ay isang mababang antas ng background.
Pagbabago
Fluorescence microscopy batay sa kabuuang panloob na pagmuni-muni ay maisasakatuparan gamit ang epi-illumination. Nangangailangan ito ng mga lente na may tumaas na numerical aperture (hindi bababa sa 1.4, ngunit ito ay kanais-nais na umabot sa 1.45-1.6), pati na rin ang isang bahagyang iluminado na field ng apparatus. Ang huli ay nakamit sa isang maliit na lugar. Para sa higit na pagkakapareho, isang manipis na singsing ang ginagamit, kung saan ang bahagi ng daloy ay naharang. Upang makakuha ng kritikal na anggulo pagkatapos kung saan nangyari ang kabuuang pagmuni-muni, isang mataas na antas ng repraksyon ng medium ng paglulubog sa mga lente at ang salamin sa takip ng mikroskopyo.
